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Accueil > Plateaux > Cytométrie et Imagerie en flux > Aide en ligne > Conseils de préparation d’échantillons

Conseils de préparation d’échantillons

N’hésitez pas à nous contacter pour des conseils spécifiques.

1) Préparation de l’échantillon
L’analyse se fait sur des cellules en suspension, prenez garde à ce que vos échantillons soient dépourvus d’agrégats. N’hésitez donc pas à filtrer les échantillons pour éviter de boucher les appareils.
La préparation des cellules est à définir en fonction de l’expérience afin d’être sûr de ne pas altérer les signaux à étudier.

2) Choix des fluorochromes
Le choix des fluorochromes dépend :
De leur spectre d’excitation : il faut que le cytomètre soit équipé d’un laser capable d’exciter le fluorochrome.
De leur spectre d’émission : il faut que le cytomètre soit équipé d’un filtre de détection capable de récolter la fluorescence émise par le fluorochrome.
De leur coefficient d’extinction molaire : le coefficient d’extinction molaire, ou brillance, rend compte de la quantité de fluorescence émise après excitation et donc de la capacité du fluorochrome à discriminer une population positive de la population négative.
Il est conseillé d’utiliser des fluorochromes ayant un coefficient d’extinction molaire supérieur pour les populations faiblement marquées.
De la compatibilité des différents fluorochromes utilisés dans le cas de marquages multiples : leurs spectres d’émission doivent être le plus distincts possible pour permettre une bonne détection et limiter les compensations.

3) Contrôles à réaliser
Simple marquage
#Cellules non marquées
#Isotype Contrôle (utilisation d’anticorps)
Double marquage
#Cellules non marquées
#Simple marquages (*2)
#Isotypes Contrôles (utilisation d’anticorps)
Multi-marquage (*n)
#Cellules non marquées
#Simple marquages (*n)
#FMOs
#Isotypes Contrôles (utilisation d’anticorps)

Cellules non marquées pour mesure autofluorescence :
Cellules ayant subi les mêmes traitements (préparation de l’échantillon, tampons,...) que les cellules marquées sans le marqueur.
➢ Réglage des paramètres

Isotypes contrôles :
Anticorps isotype de même nature, même fluorochrome, même fournisseur que l’anticorps spécifique utilisé.
➢ Vérification de la spécificité du marquage

Simples marquages :
➢ Réglage des compensations

FMO = Fluorescence Minus One :
Tous les marqueurs sauf un (par exemple dans le cas d’un triple marquage FITC/PE/APC : un tube FITC/PE, un tube PE/APC, un tube FITC/APC).
➢ Validation des compensations

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